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草莓皺縮病毒(SCV)ELISA試劑盒操作步驟
發布時間:2020-10-29   點擊次數:163次

草莓皺縮病毒(SCV)ELISA試劑盒操作步驟

草莓(Strawberry)皺縮病毒(SCV)ELISA試劑盒實驗原理

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。往預先包被皺縮病毒(SCV)抗體的包被微孔中,依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體,經過溫育並徹底洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,並在酸的作用下轉化成最終的黃色。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD 值),與CUTOFF值相比較,從而判定標本中皺縮病毒(SCV)的存在與否。

樣本處理及要求

1.  樣本不能含疊氮鈉(NaN3),因為疊氮鈉(NaN3)是辣根過氧化物酶(HRP)的抑製劑。

2.  標本采集後盡早進行提取,提取按相關文獻進行。

3.  草莓萃取液或其它相關樣本:請1000 x g離心20分鍾,取上清即可檢測。

4.  保存:如果樣本收集後不及時檢測,請按一次用量分裝,凍存於-20℃,避免反複凍融,在室溫下解凍並確保樣品均勻地充分解凍。

需要而未提供的試劑盒器材

1.酶標儀(450nm)

2.高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸餾水或去離子水

草莓(Strawberry)皺縮病毒(SCV)ELISA試劑盒組成

 

名稱

96孔配置

48孔配置

備注

微孔酶標板

12孔×8條

12孔×4條

陰性對照

0.5mL

0.5mL

陽性對照

0.5mL

0.5mL

檢測抗原-HRP

10mL

5mL

20×洗滌緩衝液

25mL

15mL

按說明書進行稀釋

樣本稀釋液

6mL

3mL

底物A

6mL

3mL

底物B

6mL

3mL

終止液

6mL

3mL

封板膜

2張

2張

說明書

1份

1份

自封袋

1個

1個

 

 

注意事項

1、嚴格按照規定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用後立即冷藏保存試劑。

2、洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入底物前確保盡量吸幹孔內液體。溫育過程中不要讓微孔幹燥掉。

3、消除板底殘留的液體和手指印,否則影響OD值。

4、底物顯色液應呈無色或很淺的顏色,已經變藍的底物液不能使用。

5、避免試劑和標本的交叉汙染以免造成錯誤結果。

6、在儲存和溫育時避免強光直接照射。

7、平衡至室溫後再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

8、任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應試劑的生物活性。

9、不能使用過期產品。

10、如果可能傳播疾病,所有的樣品都應管理好,按照規定的程序處理樣品和檢測裝置。

試劑準備

試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡後方可使用。

20×洗滌緩衝液的稀釋:蒸餾水按1:20稀釋,即1份20×洗滌緩衝液加19份蒸餾水。

操作步驟

1.從室溫平衡20min後的鋁箔袋中取出所需板條,剩餘板條用自封袋密封放回4℃。

2. 設置標準品孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50μL;

3.樣本孔待測樣本50μL;空白孔不加。

4. 除空白孔外,標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100μL,用封板膜封住反應孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5. 棄去液體,吸水紙上拍幹,每孔加滿洗滌液(350μL,靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍幹,如此重複洗板5次(也可用洗板機洗板)。

6.每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。

7.每孔加入終止液50μL,15min內,在450nm波長處測定各孔的OD值。

實驗結果計算

1.試驗有效性:  陽性對照孔OD值平均值≥1.00;

陰性對照孔OD值平均值≤0.15。

2. 臨界值(Cut off)計算:臨界值=陰性對照孔平均值+0.15

3. 陰性判斷:樣品OD值<臨界值(Cut off),樣品為陰性

4. 陽性判斷:樣品OD值>臨界值(Cut off),樣品為陽性