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人血小板生成素(TPO)ELISA試劑盒

點擊次數:276 發布時間:2020/4/14
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人血小板生成素(TPO)ELISA試劑盒

人血小板生成素(TPO)ELISA試劑盒實驗原理

人血小板生成素(TPO)試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。往預先包被血小板生成素(TPO)捕獲抗體的包被微孔中,依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體,經過溫育並徹底洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,並在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的血小板生成素(TPO)呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值),計算樣品濃度。

樣本處理及要求

1.  血清:將收集於血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜,然後1000×g離心20 分鍾,取上清即可,或將上清置於-20℃或-80℃保存,但應避免反複凍融。
2.  血漿:用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本,並將標本在采集後的30分鍾內於2-8℃ 1000×g離心15分鍾,取上清即可檢測,或將上清置於-20℃或-80℃保存,但應避免反複凍融。
3.  組織勻漿:用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)衝洗組織,去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果),稱重後將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS(一般按1:9的重量體積比,比如1g的組織樣品對應9mL的PBS,具體體積可根據實驗需要適當調整,並做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑製劑)加入玻璃勻漿器中,於冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞,可以對勻漿液進行超聲破碎,或反複凍融。最後將勻漿液於5000×g離心5~10分鍾,取上清檢測。

4.  細胞培養物上清或其它生物標本:請1000×g離心20分鍾,取上清即可檢測,或將上清置於-20℃或-80℃保存,但應避免反複凍融。

注:標本溶血會影響最後檢測結果,因此溶血標本不宜進行此項檢測。

需要而未提供的試劑盒器材

1.酶標儀(450nm)

2.高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸餾水或去離子水

血小板生成素(TPO)ELISA試劑盒組成

 

名稱

96孔配置

48孔配置

備注

微孔酶標板

8孔×12

8孔×6

標準品

0.3mL*6管

0.3mL*6管

樣本稀釋液

6mL

3mL

檢測抗體-HRP

10mL

5mL

20×洗滌緩衝液

25mL

15mL

按說明書進行稀釋

底物A

6mL

3mL

底物B

6mL

3mL

終止液

6mL

3mL

封板膜

2張

2張

說明書

1份

1份

自封袋

1個

1個

  1. 標準品濃度依次為64、32、16、8、4、0 pg/mL

2. 經過大量正常標本檢驗,標本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測範圍內,實驗過程中直接取50μL樣本上樣即可。當有部分樣本值超過最大標準品濃度時,可用樣本稀釋液將標本進行適當稀釋後再進行實驗。

 

注意事項

1、嚴格按照規定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用後立即冷藏保存試劑。

2、洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入底物前確保盡量吸幹孔內液體。溫育過程中不要讓微孔幹燥掉。

3、消除板底殘留的液體和手指印,否則影響OD值。

4、底物顯色液應呈無色或很淺的顏色,已經變藍的底物液不能使用。

5、避免試劑和標本的交叉汙染以免造成錯誤結果。

6、在儲存和溫育時避免強光直接照射。

7、平衡至室溫後再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

8、任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應試劑的生物活性。

9、不能使用過期產品。

10、如果可能傳播疾病,所有的樣品都應管理好,按照規定的程序處理樣品和檢測裝置。

試劑準備

試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡後方可使用。

20×洗滌緩衝液的稀釋:蒸餾水按1:20稀釋,即1份20×洗滌緩衝液加19份蒸餾水。

操作步驟

1.從室溫平衡20min後的鋁箔袋中取出所需板條,剩餘板條用自封袋密封放回4℃。

2. 設置標準品孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50μL;

3.樣本孔待測樣本50μL;空白孔不加。

4. 除空白孔外,標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100μL,用封板膜封住反應孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5. 棄去液體,吸水紙上拍幹,每孔加滿洗滌液(350μL,靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍幹,如此重複洗板5次(也可用洗板機洗板)。

6.每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。

7.每孔加入終止液50μL,15min內,在450nm波長處測定各孔的OD值。

實驗結果計算

所測標準品的OD值為橫坐標,標準品的濃度值為縱坐標,在坐標紙上或用相關軟件繪製標準曲線,並得到直線回歸方程將樣品的OD值代入方程,計算出樣品濃度

試劑盒性能

1、檢測範圍:1.0 pg/mL  64 pg/mL

2、靈敏度:最低檢測濃度小於1.0 pg/mL

3、特異性:不與其它可溶性結構類似物交叉反應。

4、重複性:板內變異係數小於10% ,板間變異係數小於15%