人FMS樣酪氨酸3配體（Flt3L）ELISA試劑盒說明書

人FMS樣酪氨酸3配體（Flt3L）ELISA試劑盒實驗原理

人FMS樣酪氨酸3配體（Flt3L）試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被FMS樣酪氨酸3配體（Flt3L）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫育並徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，並在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的FMS樣酪氨酸3配體（Flt3L）呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

樣本處理及要求

1.  血清：將收集於血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜，然後1000×g離心20 分鍾，取上清即可，或將上清置於-20℃或-80℃保存，但應避免反複凍融。
2.  血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，並將標本在采集後的30分鍾內於2-8℃ 1000×g離心15分鍾，取上清即可檢測，或將上清置於-20℃或-80℃保存，但應避免反複凍融。
3.  組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)衝洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果），稱重後將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據實驗需要適當調整，並做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑製劑）加入玻璃勻漿器中，於冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反複凍融。最後將勻漿液於5000×g離心5~10分鍾，取上清檢測。

4.  細胞培養物上清或其它生物標本：請1000×g離心20分鍾，取上清即可檢測，或將上清置於-20℃或-80℃保存，但應避免反複凍融。

注：標本溶血會影響最後檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

需要而未提供的試劑盒器材

1.酶標儀（450nm）

2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸餾水或去離子水

FMS樣酪氨酸3配體（Flt3L）ELISA試劑盒組成

備注：

1. 標準品濃度依次為：24、12、6、3、1.5、0 ng/mL

2. 經過大量正常標本檢驗，標本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測範圍內，實驗過程中直接取50μL樣本上樣即可。當有部分樣本值超過最大標準品濃度時，可用樣本稀釋液將標本進行適當稀釋後再進行實驗。

注意事項

1、嚴格按照規定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用後立即冷藏保存試劑。

2、洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入底物前確保盡量吸幹孔內液體。溫育過程中不要讓微孔幹燥掉。

3、消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。

4、底物顯色液應呈無色或很淺的顏色，已經變藍的底物液不能使用。

5、避免試劑和標本的交叉汙染以免造成錯誤結果。

6、在儲存和溫育時避免強光直接照射。

7、平衡至室溫後再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

8、任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應試劑的生物活性。

9、不能使用過期產品。

10、如果可能傳播疾病，所有的樣品都應管理好，按照規定的程序處理樣品和檢測裝置。

試劑準備

試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡後方可使用。

20×洗滌緩衝液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩衝液加19份蒸餾水。

操作步驟

1.從室溫平衡20min後的鋁箔袋中取出所需板條，剩餘板條用自封袋密封放回4℃。

2. 設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；

3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。

4. 除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5. 棄去液體，吸水紙上拍幹，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍幹，如此重複洗板5次（也可用洗板機洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔的OD值。

實驗結果計算

以所測標準品的OD值為橫坐標，標準品的濃度值為縱坐標，在坐標紙上或用相關軟件繪製標準曲線，並得到直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程，計算出樣品的濃度。

試劑盒性能

1、檢測範圍：0.5 ng/mL – 24 ng/mL

2、靈敏度：最低檢測濃度小於0.5 ng/mL。

3、特異性：不與其它可溶性結構類似物交叉反應。

4、重複性：板內變異係數小於10% ，板間變異係數小於15% 。